作者	翟朝阳编/国别：
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出版时间	2004-06-01

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质粒DNA的提取【原理】质粒DNA是细胞内独立存在的分子，为双链环状DNA，无蛋白质，主要存在于原核细胞和植物细胞。质粒DNA在细胞内游离于染色体外，不与染色体DNA发生整合，并以多拷贝形式存在。由于质粒DNA能在细胞内独立复制，不依赖细胞分裂和染色体的控制，所以在分子生物学中被广泛利用来作为携带外源DNA的载体，即利用分子克隆技术把外源DNA片段或基因重组到质粒DNA分子上，然后通过转化宿主细胞，获得带有外源基因或DNA片段的克隆(无性繁殖系)。靠着宿主细胞的快速繁殖和质粒本身在细胞内的复制，可以获得大量拷贝的克隆的外源基因或DN．A片段，还可以使外源基因在宿主细胞内表达出蛋白质。因此，根据质粒作为DNA载体的两个目的，可以将质粒载体分为两类：一是单纯用来克隆和扩增外源DNA片段或基因的质粒DNA分子，称之为克隆载体(克隆质粒)；另一类是在克隆载体的基础上，在质粒DNA分子多克隆位点上游的适当位置装有蛋白质表达调控元件(一般是启动子结构)的质粒，称之为表达载体(表达质粒)。根据表达调控元件的性质(真核或原核)，表达质粒又进一步分为真核表达质粒或原核表达质粒。作为载体分子，在克隆中所用的质粒应当具有几个必要的条件：(1)必须具有能在细胞内复制的复制起点，才能在宿主细胞内进行自主复制；(2)必须具有可以与外源DNA连接的多种限制性核酸内切酶的单一的酶切位点，这样才能使外源DNA与载体分子被完成切割和连接，形成重组的质粒DNA分子；(3)载体分子上应当具有可进行筛选的标记片段，如抗生素抗性基因、酶基因、营养缺陷基因等；(4)质粒载体的分子不应过大，这样才能连接一定大小的外源DNA片段。对克隆载体的要求是能够通过复制获得大量的外源DNA拷贝，因此这种载体应能在适当的宿主细胞内有更多的拷贝数；对表达载体来说，需要在多克隆插入位点的上游装备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、加尾信号、增强子等。有的表达载体还加有信号肽基因或融合蛋白基因片段，以利于表达检测或表达产物的提纯。质粒DNA的提取是分子生物学的基本操作技术，是分子生物学技术的一个基础。制备质粒DNA分子有不同的目的。为了获得纯的质粒DNA，以便进行分子克隆、蛋白质表达产物的提取和纯化或者用来转染供化细胞时，需要将带有质粒的细菌进行大量培养，从中提取出较多的质粒DNA备用。而小量提取质粒DNA常常用在克隆的鉴定上，即在重组DNA分子转化或转染细胞以后，从转化的平板或转染的细胞培养板上挑取几个菌落或细胞克隆进行鉴定。将菌落或细胞克隆按质粒DNA提取方法提取，直接进行电泳或经过酶切来判断是否带有质粒以及质粒上是否有外源DNA分子插入。如有，证明重组成功；如无，则需再从更多的克隆提取质粒DNA进行鉴定。小量提取质粒DNA分子具有快速、简便的优点。一般一个人一次可同时做多个克隆的鉴定。小量质粒分子DNA的提取是初学者做分子生物学实验的**步。大量的分子生物学研究是围绕着核酸分子展开的，掌握这项技术，对每一个从事分子生物学工作的人来说都是必需的。【方法】1．有质粒的宿主菌的培养：用接种环在酒精灯火焰上烧红灭菌并冷却后，从细菌平板上挑取单个菌落，接种至装有2ml～3mlLB培养基的中试管中，370(2摇床振摇培养12h；或者直接从保存的液体菌种中蘸取少量细菌，接种到中试管中，同样3713振荡培养12h；或者用接种环直接从培养的细菌平板上刮取单个克隆，接种到装有1．5mlTE缓冲液的Eppendorf离心管中。2．从过夜培养的细菌液中取1．5ml装入Eppendorf离心管，用台式离心机以12000r／min离心30s。如果是刮取的细菌克隆，则直接离心。3．倒去上清液，将离心管倒放在实验桌面的卫生纸上以控干离心管中．的培养液。4．加入100IA溶液工，用漩涡振荡器将沉淀充分悬浮，或用移液器吹吸的方式反复吹吸，使细菌沉淀充分悬浮。室温放置5mino5．加人200~1的溶液Ⅱ(临时配制)，盖紧管盖后温和颠倒离心管3～5次，使管内液体充分混匀，冰浴5min。6．加入150l的溶液Ⅲ，猛甩离心管2次，使管内液体混匀，冰浴3mlno7．以12000r／min离心5min(室温或4℃)。8．用移液器将上清液吸到另一Eppendorf离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒离心管，使管内液体混匀。以12000r／min离心10m．in(室温)。9．倒去上清液，将离心管倒放在桌面的卫生纸上，尽量控干(约5min)。10．加人15t-dIE缓冲液，在沉淀位置将沉淀溶解，以供电泳检测。酶联免疫吸附测定(erlzylne—linkedimmunosorbentassay，ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatictechnique)的基础上发展起来的免疫测定技术，现已经成为临床医学的常规检测技术，用于检测抗体、抗原或半抗原。ELISA的技术包括固相载体吸附抗体(抗原)(又称之为包被)，加入待测抗原(抗体)，再与相应的酶标记抗体(抗原)进行抗原抗体的特异免疫反应，生成抗体(抗原)—待测抗原(抗体)—酶标记抗体(抗原)的复合物，*后与该酶的底物反应生成有色产物。由于待测抗原(抗体)的量与生成的有色产物成正比，所以可借助光吸收率计算抗原(抗体)含量。酶结合物是酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产物，它是ELISA成败的关键试剂。ELISA不仅具有抗原抗体特异的免疫学反应，还具有酶促反应，因而显示出生物放大作用。制备的酶结合物必须符合高纯度、高活性、单价性三个条件。其中的酶应具有性能稳定、经济易得、单独使用时对底物不产生颜色反应、只有终产物显色以及便于检测等特点。常用的酶有碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horseradperoxidase，ImP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等(表7—1)。它们均可催化相应的无色底物产生有色产物，并有特定的光吸收峰，终止酶促反应后，底物不再改变。……